Thomas Gammeltoft begyndte sin filmkarriere med den lille kortfilm "Den sidste vals", som han lavede med hjælp fra venner og bekendte, mens han gik på andet semester på film- og medievidenskab på Københavns Universitet. Efterfølgende blev han hyret af filminstruktøren Henning Carlsen som chauffør for stjernen Donald Sutherland, der medvirkede i Carlsens film "Oviri". Senere blev han ansat i dokumentarfilmkollektivet Film & Lyd. Sammen med instruktøren Anders Østergaard var han med til at lave filmene "Gensyn med Johannesburg", "Troldkarlen" og "Tintin et Moi". Han var også med til at lave serien "Åndernes magt", novellefilmen "Tilbage til kærligheden" og spillefilmen "Baby Doom". Som 37-årig fik han ideen til filmsuccesen "En kort en lang", hvilken film kickstartede hans karriere som spillefilmproducer og producent, idet han sammen med Hella Joof og instruktøren Jannik Johansen lancerede selskabet Fine & Mellow. I det regi skabtes kommercielle succeser som "Rembrandt", "Oh Happy Day", "Mørke" og "Fidibus", Sidenhen dannede Thomas Gammeltoft makkerpar med Henrik Ruben Genz omkring filmene "Kinamand", "Undskyld jeg forstyrrer" og "Frygtelig lykkelig", som vandt både Bodil- og Robert-priser i 2010. I 2013 blev Thomas Gammeltoft udpeget som direktør for Copenhagen Film Fund, hvor fondens midler skal benyttes til internationale filmproduktioner i hovedstadsområdet.